【顯微課堂】高質(zhì)量超薄切片：自動(dòng)對(duì)刀

透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）等電子顯微鏡技術(shù)，廣泛應(yīng)用于獲取生物或非生物材料樣品的結(jié)構(gòu)信息。在電子顯微鏡（EM）應(yīng)用中，較厚的樣品被切割成厚度小于100納米的超薄切片。

該樣品制備方法有助于獲取高分辨率的電子顯微鏡圖像，并且能夠進(jìn)一步通過計(jì)算重建從多個(gè)連續(xù)切片中收集的信息，從而獲得較厚樣品的概覽（體積電子顯微鏡學(xué)）。

在對(duì)樣品塊進(jìn)行修整以獲得平坦且暴露的塊面后，將其正確對(duì)齊到切片刀邊緣至關(guān)重要。最終目標(biāo)是使樣品與切割平面之間的距離盡可能小，以避免樣品材料損失和切片不完整。

wanmei對(duì)齊樣品和切片刀是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。它需要精密地手動(dòng)調(diào)整樣品傾斜、旋轉(zhuǎn)和切片刀角度，同時(shí)需要正確地控制樣品進(jìn)給（進(jìn)刀）。

這對(duì)于新手或不常使用超薄切片機(jī)的用戶來說尤其困難。不僅存在損壞昂貴切片刀的風(fēng)險(xiǎn)，而且還可能損壞樣品，無法用于切片。即使經(jīng)驗(yàn)豐富的操作人員也需要小心謹(jǐn)慎，以確保在較薄樣品（如細(xì)胞單層）切片過程中，不會(huì)因初始位置未對(duì)齊，而損失太多材料。

為了判斷切片刀與樣品之間的距離，用戶需要使用底照光來觀察它們之間的間隙，整個(gè)過程在體視顯微鏡下進(jìn)行。底照光從下方照亮切片刀的背面，并通過樣品塊面的光滑表面反射光線，呈現(xiàn)為一條明亮的條紋（圖4）。這被稱為“光隙"。

wanmei對(duì)齊表現(xiàn)為在整個(gè)塊面長(zhǎng)度上均勻?qū)挾鹊谋。ㄋ{(lán)色）光隙（見下文）。

樣品傾轉(zhuǎn)是最關(guān)鍵但不易觀察的影響參數(shù)之一。如果樣品傾轉(zhuǎn)不正確，切片刀在切割過程中將不會(huì)與樣品運(yùn)動(dòng)保持一致。因此，在獲得完整切片之前，可能會(huì)丟失珍貴的樣品。

通過弧形樣品夾以調(diào)整塊面與切片刀邊緣之間的角度，可以調(diào)節(jié)樣品傾轉(zhuǎn)。以光隙為指標(biāo)，用戶在調(diào)整過程中需要上下移動(dòng)樣品，直到光隙在整個(gè)塊面上顯示相同的厚度（圖7）。

這需要通過迭代方法來調(diào)整樣品傾轉(zhuǎn)。在這個(gè)階段，切勿將切片刀太靠近樣品，否則塊面的離切片刀較近部分可能會(huì)被wanquan切掉，從而有損失整個(gè)樣品的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，也存在切片刀損壞的風(fēng)險(xiǎn)。

樣品和切片刀角度調(diào)整的最后一步是使用光隙作為指標(biāo)進(jìn)行調(diào)整。在調(diào)整樣品傾轉(zhuǎn)之后，小心地將切片刀朝樣品推進(jìn)，直到切片刀與塊面之間的光隙幾乎看不見。在接近過程中，光隙的顏色會(huì)發(fā)生變化，直到最終變?yōu)樗{(lán)色（顏色的變化是衍射的結(jié)果，圖8）。使用這種方法，在整個(gè)塊面上對(duì)齊偏差能夠小于1µm。從塊面反射出的藍(lán)色光隙，通常表示塊面與切片刀之間的距離約為400納米。在此距離下，在所有角度上均勻分布的光隙是zui精確指標(biāo)，盡可能減小材料的損失。

圖8：精細(xì)調(diào)整過程中，切片刀與塊面之間衍射產(chǎn)生的藍(lán)色光隙。

對(duì)齊過程會(huì)引導(dǎo)用戶完成接近階段，最終對(duì)齊步驟將自動(dòng)完成。這種自動(dòng)化設(shè)計(jì)旨在保護(hù)切片刀和塊面免受損壞，同時(shí)幫助用戶實(shí)現(xiàn)wanmei對(duì)齊。該功能幫助未經(jīng)過培訓(xùn)的用戶，如在核心設(shè)施或研究組內(nèi)工作的用戶，在切片刀和樣品的初始定位階段，在不承擔(dān)損壞風(fēng)險(xiǎn)的情況下獲得高質(zhì)量切片。

需要注意的是，要執(zhí)行wanquan自動(dòng)對(duì)齊功能，必須滿足某些先決條件。例如，塊面尺寸必須至少為250 x 250µm，最大為1200 x 1200µm。此外，塊面必須具有反射性且足夠干凈。

軟件檢測(cè)圖像中的不同邊緣，并對(duì)切片刀角度、樣品傾斜和樣品旋轉(zhuǎn)進(jìn)行迭代對(duì)齊。在此過程中，樣品會(huì)上下?lián)u動(dòng)，以觀察分析整個(gè)塊面范圍的光隙，并據(jù)此調(diào)整樣品傾斜。

在過程結(jié)束時(shí)，可以自動(dòng)將切片刀接近樣品，直到大約5µm的距離（圖12）。如果需要，也可以進(jìn)行手動(dòng)校正。

對(duì)齊過程的目的是避免在獲得完整切片之前，不必要地?fù)p失部分樣品區(qū)域。為了提供確鑿的證據(jù)，證明自動(dòng)對(duì)齊功能能夠可靠地產(chǎn)生高質(zhì)量切片，我們對(duì)樣品進(jìn)行了一系列超薄切片測(cè)試。

在第一組代表性樣品中，專家手動(dòng)進(jìn)行了對(duì)齊。通常，專家需要切割5-10個(gè)厚度為100nm的部分切片，直到獲得完整切片。另一組樣品使用UC Enuity的自動(dòng)對(duì)齊功能進(jìn)行修塊，其中五個(gè)不同樣品使用不同設(shè)備進(jìn)行修塊，樣品塊面尺寸不同。在兩組測(cè)試中，部分切片的平均數(shù)量均低于或等于10，而最少部分切片的數(shù)量在3到7之間（表2）。這證明使用UC Enuity可以成功實(shí)現(xiàn)自動(dòng)對(duì)齊。