高效的長期延時拍攝技術(shù)

研究球狀體的形成

當對球狀體做延時拍攝技術(shù)時，會出現(xiàn)某些挑戰(zhàn)。由于實驗可能持續(xù)數(shù)天，必須實現(xiàn)長時間的樣本存活，這就需要確保接近生理條件。本文描述的長期延時研究使用了全場景顯微成像分析平臺MICA來研究U343和MDCK細胞球形成。細胞球生長需要最佳條件，以確保細胞周期和增殖不受干擾。

圖像：每孔1000個被穩(wěn)轉(zhuǎn)了MX1 GFP（綠色）的MDCK細胞形成的3D細胞球。72小時延時拍攝，間隔30分鐘?；疑荌MC。

延時拍攝技術(shù)

延時拍攝技術(shù)[1,2] 是指在一定的時間內(nèi)，通過顯微鏡以特定的速率（通常為幀/秒（fps））捕捉標本的圖像

如果圖像捕獲率低于用于觀察記錄圖像的觀察率，那么在觀察像視頻一樣的圖像序列時，時間就會顯得更快。同樣，如果圖像捕獲率高于觀察率，那么時間似乎就會變慢。因此，延時顯微鏡檢查能夠觀察到長時間的微觀事件，即在幾分鐘、幾小時或幾天內(nèi)發(fā)生的事件，在幾秒鐘、幾分鐘或幾小時內(nèi)就能看到。延時顯微鏡檢查用于研究活體標本，如細胞培養(yǎng)物、急性組織樣本和模式生物隨著時間的推移而生長和發(fā)展，以獲得更多關(guān)于生物過程的見解[3,4]。

例如，在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、免疫系統(tǒng)功能和腫瘤細胞侵襲過程中，細胞遷移對多細胞生物體非常重要。為了準確跟蹤細胞和生物體隨時間的變化，可以采用“縱向"研究[5] ，即在規(guī)定的時間內(nèi)，在特定的條件下觀察同一樣本或標本。

細胞球

細胞球是一種三維細胞培養(yǎng)，就像類器官一樣，它模擬活體組織和器官的生理功能[6]。單層二維細胞培養(yǎng)物通常是在基質(zhì)上平坦生長的細胞，細胞球和其他3D細胞培養(yǎng)物則可以大量生長，從而實現(xiàn)細胞-細胞之間的三維相互作用，這更像有機體中的原生組織。這些3D細胞培養(yǎng)物可用于研究，以幫助更好地了解更真實的微環(huán)境中的細胞。細胞球在神經(jīng)科學(xué)、再生醫(yī)學(xué)以及癌癥和心血管研究方面的應(yīng)用非常有用。

挑戰(zhàn)

當用細胞球做延時顯微鏡拍攝時，會出現(xiàn)某些挑戰(zhàn)。由于實驗可能持續(xù)數(shù)天、甚至數(shù)周，因此必須在保證接近生理條件的情況下，延長樣品的存活時間。熒光標記物的表達必須保持在內(nèi)源性水平，以防止損害細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

培養(yǎng)基中必須有穩(wěn)定的營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)和濃度不變的物質(zhì)，否則這種物質(zhì)的濃度可因蒸發(fā)而降低。長時間的正確成像要求顯微鏡成像保持聚焦，并適應(yīng)不斷變化的樣品特征，如橫向和軸向生長。

研究實驗室可能沒有涉及3D細胞培養(yǎng)的延時顯微鏡工作所需的儀器。這種情況下，通常通過在多個研究小組和用戶間共享設(shè)施來解決，但這可能意味著在獲得所需儀器之前需要漫長的等待時間。這些挑戰(zhàn)可能會導(dǎo)致延遲獲得重要的、可量化的結(jié)果，而這些結(jié)果將影響根本性突破和獲得新的見解。

Mica介紹

MICA是全場景顯微成像分析平臺，它將研究人員需要的一切都統(tǒng)一在一個wan quan可控的、高度靈活的環(huán)境中，加速顯微鏡的工作流程，以便更快地獲得有意義的科學(xué)結(jié)果。通過使用這個成像分析平臺，您可以從以下方面受益：

人人皆享：輕松設(shè)置受控環(huán)境條件，匹配聚焦策略，并設(shè)置成像條件

機制簡化工作流程：屏幕上注釋和提取多個參數(shù)

觸手可及：最佳的環(huán)境條件和多種成像模式（明場、寬場和共聚焦），以配合實驗需要，以及水鏡和聚焦策略的智能自動化

方法

這項長期延時研究是使用MICA來研究從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了MX1-GFP或 U343細胞開始的細胞球的形成。細胞球生長需要最佳的生理條件，確保細胞周期和增殖不受干擾[6,7]。

以往的研究結(jié)果表明，生長本身往往與特定的蛋白質(zhì)或細胞狀態(tài)和分化的某些標記物的表達相關(guān)[6,7]。

圖1：圖示細胞隨時間而形成的細胞球。

MICA在這一關(guān)鍵應(yīng)用中作為一種培養(yǎng)箱，在接近生理條件下維持3D細胞培養(yǎng)和細胞球，并最大限度地減少培養(yǎng)基蒸發(fā)。MICA可幫助用戶測量細胞球的生長并分析蛋白質(zhì)的表達水平。

圖2和圖3顯示了在3D細胞球的形成及其生長的長期延時研究中獲得的圖像和數(shù)據(jù)。

視頻 1：左半部分：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了MX1-GFP的MDCK細胞（整合調(diào)制反差I(lǐng)MC[灰色]和熒光[綠色]），右半部分：野生型U343細胞（整合調(diào)制反差[灰色]）。圓底60孔多孔板間隔時間為30分鐘拍攝72小時的延時視頻。

圖2：對60個孔隨時間變化的分析：紅色表示經(jīng)過訓(xùn)練的像素分類器在60小時成像后的某個時間點檢測到的區(qū)域。

圖3：上排：每孔1000個MDCK細胞形成3D細胞球的延時序列中選出的圖像，其中細胞用MX1 GFP（綠色）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。這些圖像分別是在接種細胞后第0、11、20、40和61小時的時間點拍攝的。圖中所示的紅色曲線是對形成的MDCK細胞球狀體大小的相應(yīng)測量。
下排：每孔1000個U343細胞形成3D細胞球的延時序列中選出的圖像。

這些圖像也是在接種細胞后第0、11、20、40和61小時的時間點拍攝的。

圖中所示的綠色曲線是對形成的U343細胞球體大小的相應(yīng)測量。

參考資料

1. J.L. Collins, B. van Knippenberg, K. Ding, A.V. Kofman, Time-Lapse Microscopy, Ch. 3 in Cell Culture, Ed. R. Ali Mehanna (IntechOpen, London, 2018) ISBN: 978-1-78984-867-0, DOI: 10.5772/intechopen.81199.

2. Time-Lapse Microscopy: Technique and Significance, Looking at Cell Migration: What is Time-Lapse Microscopy (TLM)? Microscope Master.

3. Live-Cell Imaging Techniques Visualizing the Molecular Dynamics of Life, Science Lab (2022) Leica Microsystems.

4. T. Veitinger, Introduction to Live-Cell Imaging, Science Lab (2012) Leica Microsystems.

5. R.R. Shields-Cutler, G.A. Al-Ghalith, M. Yassour, D. Knights, SplinectomeR Enables Group Comparisons in Longitudinal Microbiome Studies, Front. Microbiol. (2018) vol. 9, DOI: 10.3389/fmicb.2018.00785.

6. N. Kalebic, P. Kanrai, J. Kulhei, Observing 3D Cell Cultures During Development, ?Science Lab (2021) Leica Microsystems.

7. S.S. Nazari, Generating 3D spheroids with encapsulating basement membranes for invasion studies, Curr. Protoc. Cell Biol. (2020) vol. 87, iss. 1, e105, DOI: 10.1002/cpcb.105.