相分離與顯微成像

相分離/相變

（Phase separation，Phase Transition）

相分離/相變是近幾年生化、細(xì)胞生物學(xué)新興且十分火熱的研究領(lǐng)域。Hyman和Brangwynne 2009年在Science發(fā)表了題為：Germline P granules are liquid droplets that localize by controlled dissolution/condensation 的文章，提出了細(xì)胞內(nèi)通過“相分離"，可以提供一種特定的方式讓細(xì)胞內(nèi)的特定分子聚集起來，從而在“混亂的"細(xì)胞內(nèi)部形成一定“秩序"，為困擾了大家多年的問題，提供了全新的思路。
 

分離或相變（Phase separation，Phase transition）描述的是細(xì)胞里不同成分間相互碰撞、融合形成液滴，從而使一些成分被包裹在液滴內(nèi)、一些成分被阻隔在液滴外的現(xiàn)象，就如同水油相混，細(xì)胞里的不同成分也會(huì)相互分離，形成液滴，這就是相分離。后續(xù)的大量研究也讓生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)相分離在細(xì)胞生物學(xué)中無處不在。2011年，Hyman, Mitchison 和 Brangwynne又發(fā)現(xiàn)核仁有液滴現(xiàn)象，后續(xù)研究相繼發(fā)現(xiàn)RNA和蛋白質(zhì)分子間存在較弱的作用力，形成液滴類的物質(zhì)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)存在相分離現(xiàn)象；至2018年CNS上已發(fā)表十幾篇重要級(jí)文章證實(shí)相分離的廣泛存在和重要性。
 

圖1. 細(xì)胞內(nèi)的油滴藝術(shù) 
 

細(xì)胞內(nèi)的相分離

細(xì)胞中存在各種無膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器：顆粒、核仁、Cajal bodies、stress granules、miRISC及突觸的細(xì)胞骨架等，相分離廣泛發(fā)生于各種成分之間。
 

蛋白質(zhì)或RNA分子

蛋白質(zhì)或RNA分子間的物理作用力可以使它們相互分開或聚集。一旦分子達(dá)到一定濃度，它們就會(huì)發(fā)生相分離，相似的成分聚集在一起加速生物學(xué)反應(yīng)（類似于相似相容），或者隔離無關(guān)的分子。
 

細(xì)胞膜上的信號(hào)傳遞

在神經(jīng)細(xì)胞中，細(xì)胞間進(jìn)行信號(hào)傳遞時(shí)，蛋白質(zhì)在連接處的聚集和相分離是保證細(xì)胞間信號(hào)傳遞正常進(jìn)行所必需的。
 

DNA折疊包裝

在細(xì)胞核中，相分離幫助壓縮折疊不使用的DNA并抑制其活性。一些可能與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的蛋白被阻隔在外。
 

液滴成為障礙 

在肌萎性脊髓側(cè)索硬化癥中，分離成液滴的蛋白質(zhì)會(huì)逐漸凝結(jié)、變硬，形成有害的固體物質(zhì)。

圖2. 細(xì)胞內(nèi)的相分離

相分離的主要應(yīng)用

隨著相分離的研究逐漸增多，研究人員發(fā)現(xiàn)相分離在無膜器官的形成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架、超分子組裝、基因激活等方面起著重要作用，相分離異常可能導(dǎo)致如神經(jīng)退行性疾病、腫瘤、衰老等。
 

神經(jīng)退行性疾病

在肌萎側(cè)索硬化（ALS） （一種運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾?。?中觀察到“相分離"，發(fā)現(xiàn)FUS蛋白和hnRNPA1在ALS中形成液滴，液滴粘性逐漸變強(qiáng)，最終形成纖維狀的固體，在ALS中異常沉積。
 

阿爾茨海默病患者腦內(nèi)異常沉積的tau蛋白也存在相分離，相分離可能是tau蛋白聚集的初始觸發(fā)因素。

圖3. FUS蛋白相分離作用圖解；FUS蛋白相分離熒光圖像
 

腫瘤

分子病理學(xué)家Miguel Rivera和他的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一種與尤文氏肉瘤有關(guān)的蛋白。這種蛋白聚集在與腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因組附近時(shí)可激活致癌基因表達(dá)，而異常的相分離就可能促使這種蛋白在這些區(qū)域附近聚集。
 

細(xì)胞保護(hù)作用

Hyman和Alberti發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞在低pH的壓力環(huán)境下，一些重要蛋白會(huì)聚集成液滴啟動(dòng)保護(hù)機(jī)制。當(dāng)pH回升后，這些液滴會(huì)分散開，細(xì)胞恢復(fù)正常的功能。
 

相分離研究中使用的主要技術(shù)

研究相分離涉及的相關(guān)步驟及技術(shù)有很多，首先通常會(huì)用到體外重構(gòu)相分離，通過將目標(biāo)物質(zhì)表達(dá)純化，在體外重構(gòu)相分離的過程，證明存在相分離機(jī)制。其次，相分離研究的關(guān)鍵是要證明所研究的目標(biāo)物質(zhì)（蛋白、RNA等）存在動(dòng)態(tài)可逆的聚集-解聚狀態(tài)變化，并且這一變化與目標(biāo)物質(zhì)的功能有關(guān)。因此如何證明這種動(dòng)態(tài)變化狀態(tài)是關(guān)鍵。
 

這一過程包括觀察相分離的技術(shù)以及影響和調(diào)控相分離過程的技術(shù)，如：顯微成像技術(shù)、光調(diào)控系統(tǒng)（OptoDroplets、CasDrop）、溶液渾濁度檢測(cè)、離心沉淀法、表面張力測(cè)定（反毛細(xì)管速度+被動(dòng)微流變學(xué)）、液滴內(nèi)部硬度測(cè)定（原子力顯微鏡或光鑷）、聚合物網(wǎng)格孔徑測(cè)定（熒光標(biāo)記右旋糖苷）等。
 

顯微成像作為觀察相分離的主要技術(shù)，在相分離中發(fā)揮著*的作用。按觀察方式主要涉及明場(chǎng)光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡。明場(chǎng)顯微鏡中主要通過微分干涉（DIC）、相差（PH）、偏光（POL）等方法觀察體外、無標(biāo)記的相分離溶液，可獲得液滴形成過程、大小及隨時(shí)間變化、液滴內(nèi)部纖維性或固態(tài)樣結(jié)構(gòu)各項(xiàng)異性等結(jié)果。對(duì)于體外和體內(nèi)熒光標(biāo)記的研究對(duì)象，則采用熒光顯微鏡去觀察并獲取高分辨的液滴形成過程、大小及隨時(shí)間變化的熒光圖像，以及分子擴(kuò)散性和液滴內(nèi)部分子擴(kuò)散能力等研究。
 

明場(chǎng)顯微鏡

運(yùn)用明場(chǎng)顯微鏡DIC或者PH的功能，可以獲得：

• 液-液相分離形成的液滴，得到形成時(shí)間、輪廓大小、融合或裂變擴(kuò)散等信息；

• 隨著加入藥物處理，可觀察液滴大小變化、融合或者裂變擴(kuò)散。

如圖4，在DIC明場(chǎng)顯微鏡模式下觀察隨時(shí)間變化，液滴形態(tài)大小的變化。

圖4. DIC明場(chǎng)顯微鏡觀察相分離隨時(shí)間的變化過程 
 

熒光顯微鏡

因其分辨率高，能夠清晰觀察靜態(tài)液滴輪廓邊界以及亞細(xì)胞的分子結(jié)構(gòu)（如圖5），對(duì)于動(dòng)態(tài)過程的采集，也能獲取更為清晰的圖像，是相分離成像的主要觀察手段。

圖5. 小鼠胚胎干細(xì)胞相分離免疫熒光圖像
 

圖6. HeLa細(xì)胞核中蛋白聚集、分離形成小液滴
 

激光共聚焦顯微鏡

除了上述檢測(cè)液滴輪廓、大小，融合裂變、分子結(jié)構(gòu)、定位等實(shí)驗(yàn)外，在激光掃描共聚焦顯微鏡上還可以進(jìn)一步利用熒光漂白后恢復(fù)實(shí)驗(yàn)（FRAP）檢測(cè)液滴中的擴(kuò)散行為。FRAP實(shí)驗(yàn)原理是使用高強(qiáng)度激光將對(duì)選定區(qū)域進(jìn)行漂白，然后觀測(cè)該區(qū)域熒光強(qiáng)度隨時(shí)間恢復(fù)的動(dòng)力學(xué)過程。FRAP是非常有效的研究分子動(dòng)力學(xué)變化的技術(shù)手段，它可檢測(cè)體外和體內(nèi)的相分離、可評(píng)估液滴內(nèi)部的同質(zhì)性，具備激光功率可控、靈活照明控制、靈活選擇漂白區(qū)域等*優(yōu)勢(shì)，在相分離研究中能發(fā)揮重要作用?；诠簿劢癸@微鏡的FRAP實(shí)驗(yàn)除了可以獲取高分辨圖像，還能獲取動(dòng)態(tài)的漂白恢復(fù)曲線信息（如圖7），更好地評(píng)估相分離中的動(dòng)力學(xué)過程。

圖7. 基于激光共聚焦顯微鏡的FRAP實(shí)驗(yàn)研究相分離
 

如需觀察更為微觀的納米結(jié)構(gòu)，可以使用超高分辨共聚焦顯微鏡，實(shí)現(xiàn)50nm的解析精度，也可使用電子顯微鏡做進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析。
 
 
 

參考文獻(xiàn)：

1.Nature|doi:10.1038/d41586-018-03070-2

2.Sabari et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science 2018

3.Qamar et al. FUS Phase Separation Is Modulated by a Molecular Chaperone and Methylation of Arginine Cation-p Interactions. Cell 2018

4.Boulay et.al. Cancer-Specific Retargeting of BAF Complexes by a Prion-like Domain. Cell 2017  

5.Zeng et al. Phase Transition in Postsynaptic Densities Underlies

Formation of Synaptic Complexes and Synaptic Plasticity. Cell 2016

6.Simon Alberti, et al. Considerations and Challenges in Studying Liquid-Liquid Phase Separation and Biomolecular Condensates. Cell 2019  

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