顯微鏡在病毒學(xué)中的應(yīng)用

顯微技術(shù)

引起新型病毒肺炎的冠狀病毒SARS-CoV-2肆虐全球并影響了我們生活的方方面面。對(duì)于免疫和治療方法的搜索研究（即如何抗擊該病毒）成為了2020年人類(lèi)的第一要?jiǎng)?wù)。顯微鏡在這類(lèi)研究中起著重要作用。

為了了解受體結(jié)合、基因組釋放、復(fù)制、裝配和病毒出芽的基本原理以及我們的免疫系統(tǒng)效應(yīng)，可以使用不同的方法和顯微鏡。本文概述了為什么顯微鏡是病毒學(xué)和感染生物學(xué)的重要工具，并舉例說(shuō)明了不同的顯微技術(shù)及其在這些研究領(lǐng)域中的應(yīng)用。

｜顯微鏡在病毒學(xué)領(lǐng)域內(nèi)有著廣泛應(yīng)用｜

光學(xué)顯微鏡對(duì)于病毒學(xué)家來(lái)說(shuō)應(yīng)用范圍很廣。大多數(shù)光學(xué)顯微鏡是基于熒光的。熒光顯微鏡大致可分為免疫熒光和熒光蛋白的利用。免疫熒光利用固定的細(xì)胞或組織，用熒光標(biāo)記的抗體對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行染色，而熒光蛋白也可用于活細(xì)胞成像。

病毒學(xué)中使用的顯微鏡包括寬場(chǎng)顯微鏡、共聚焦顯微鏡和超分辨顯微鏡。此外，激光顯微切割也具有一定的適用性。

以下參考文獻(xiàn)將讓您概括了解比較突出的顯微鏡檢查方法及其在病毒學(xué)中的應(yīng)用：

細(xì)胞脂質(zhì)代謝對(duì)新型病毒復(fù)制的影響

Müller等人研究了細(xì)胞脂質(zhì)代謝對(duì)冠狀病毒復(fù)制的影響。他們用冠狀病毒HCov-229E感染Huh-7細(xì)胞，并用抗dsRNA、冠狀病毒N蛋白和冠狀病毒NSP8蛋白的抗體對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行染色。此外，他們還利用胞體磷脂PC-A2標(biāo)記。然后用配備63x平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡的TCS SP5共聚焦顯微鏡進(jìn)行成像。研究人員集中研究了dsRNA和PC-A2的共定位。

細(xì)胞質(zhì)磷脂酶A2α（cPLA2α）產(chǎn)生磷脂。當(dāng)他們用cPLA2α抑制劑處理細(xì)胞時(shí)，他們可以檢測(cè)到對(duì)人類(lèi)冠狀病毒細(xì)胞中病毒RNA和蛋白質(zhì)積累的顯著影響。進(jìn)一步研究之后，他們觀察到RTC（病毒復(fù)制/轉(zhuǎn)錄復(fù)合物）與含有溶血磷脂的膜結(jié)構(gòu)共定位。有鑒于此，他們得出結(jié)論，cPLA2α可能是抗病毒的藥物靶點(diǎn)。

病毒有自己的RNA或DNA。鑒于這一事實(shí)，病毒可以通過(guò)熒光原位雜交(FISH)技術(shù)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，期間使用熒光探針對(duì)病毒核苷酸進(jìn)行標(biāo)記。

圖1：病毒粒子的典型結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)如聚合酶、核酸（RNA或DNA）、脂質(zhì)雙層（包被）、包膜蛋白、核糖核蛋白和衣殼。

免疫抑制機(jī)制的監(jiān)測(cè)標(biāo)志物

Jarret等人并沒(méi)有對(duì)病毒進(jìn)行研究而是對(duì)小鼠黏膜屏障的細(xì)菌感染進(jìn)行了研究。通過(guò)單分子熒光原位mRNA雜交（smFISH；THUNDER Imager 3D Live Cell) ，他們發(fā)現(xiàn)腸神經(jīng)元產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-18。他們據(jù)此可以證明神經(jīng)元衍生的IL-18信號(hào)在腸道免疫中起主要作用，這一研究成果此前尚未被發(fā)現(xiàn)。

免疫抑制機(jī)制的監(jiān)測(cè)標(biāo)志物

免疫抑制可以在病毒感染小鼠模型的幫助下進(jìn)行研究。對(duì)小鼠肺部進(jìn)行了大型多通道掃描，以監(jiān)測(cè)免疫抑制機(jī)制的標(biāo)志物。用流感病毒感染小鼠，然后研究肺基底樣結(jié)構(gòu)的退行性變化 (THUNDER Imager 3D Cell Culture)。

圖2：免疫熒光，角蛋白-5（綠色），PDL-1（紅色）：小鼠肺切片，接種Puerto Rico 8流感病毒毒株誘導(dǎo)肺上皮損傷。感謝Cedars-Sinai醫(yī)療中心Andrew Beppu提供圖片。

DENV誘導(dǎo)基因表達(dá)效應(yīng)

Sim等人研究了登革熱病毒（DENV）在黃熱病蚊（埃及伊蚊）唾液腺中誘導(dǎo)的基因表達(dá)效應(yīng)。作者發(fā)現(xiàn)，感染DENV后，蚊子唾液腺的轉(zhuǎn)錄組發(fā)生了改變。利用基因表達(dá)芯片進(jìn)行基因表達(dá)分析，他們第一次發(fā)現(xiàn)了一些基因的表達(dá)，這些基因?qū)ξ米訉ふ液吞綔y(cè)寄主的行為有影響。他們使用免疫熒光顯微鏡來(lái)識(shí)別蚊子化學(xué)感受器中病毒豐富的區(qū)域（見(jiàn)圖3）。

圖3：Sim等人檢驗(yàn)埃及伊蚊在感染登革病毒后的唾液腺。

亨德拉病毒感染細(xì)胞的形態(tài)

Monaghan等人在顯微鏡的幫助下對(duì)亨德拉病毒感染細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行了特征分析。共焦圖像 (TCS SP5) 揭示了細(xì)胞內(nèi)病毒蛋白質(zhì)的分布，而超高分辨率顯微鏡 (SR-GSD) 甚至可以近距離觀察病毒顆粒內(nèi)的蛋白質(zhì)分布。

與拉克羅斯病毒（LACV）核衣殼結(jié)合的細(xì)胞RNA解旋酶

Weber等人利用超高分辨率顯微鏡對(duì)與拉克羅斯病毒（LACV）核衣殼 (SR-GSD)相結(jié)合的細(xì)胞RNA解旋酶進(jìn)行了研究。為此要在感染的A549細(xì)胞當(dāng)中使用免疫熒光來(lái)對(duì)病毒LACV N蛋白質(zhì)和細(xì)胞RNA解旋酶RIG-I進(jìn)行染色。超高分辨率顯微鏡提供了RIG-I通過(guò)5’ppp dsRNA長(zhǎng)鏈與核衣殼相結(jié)合的生化數(shù)據(jù)。

自然殺傷（NK）細(xì)胞

Maze和Orange研究了病毒中的重要對(duì)手——自然殺傷（NK）細(xì)胞。這些細(xì)胞從屬于先天免疫系統(tǒng)，負(fù)責(zé)監(jiān)視病毒感染和癌變細(xì)胞。通過(guò)免疫突觸直接分泌特異性外泌體，殺死病毒感染的細(xì)胞。用STED納米顯微鏡 (TCS SP8 STED) 研究了裂解顆粒與NK細(xì)胞骨架的相互作用。

圖4：病毒復(fù)制周期從與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合開(kāi)始。在內(nèi)吞作用后，病毒內(nèi)容物被釋放到宿主細(xì)胞中。RNA（RNA病毒）可以直接翻譯成蛋白質(zhì)，而DNA（DNA病毒）必須首先轉(zhuǎn)錄。此外，病毒基因組在細(xì)胞核或所謂的病毒工廠中復(fù)制。之后，病毒組分組裝起來(lái)再次形成一個(gè)完整的病毒顆粒，通過(guò)宿主細(xì)胞的質(zhì)膜實(shí)現(xiàn)萌芽再感染其他細(xì)胞。溶胞病毒不會(huì)萌芽，但會(huì)破壞宿主細(xì)胞釋放。

STED納米顯微鏡成像免疫突觸

Zheng等人的另一篇發(fā)表文獻(xiàn)中闡述了使用STED納米顯微鏡 (TCS SP8 STED)對(duì)免疫突觸進(jìn)行成像的技術(shù)流程。

STED納米顯微鏡揭示寄生蟲(chóng)學(xué)問(wèn)題

除了病毒學(xué)和免疫學(xué)外，STED納米顯微鏡還能夠揭示寄生蟲(chóng)學(xué)問(wèn)題，例如紅細(xì)胞裂殖子入侵。3D STED (TCS SP8 STED) 發(fā)現(xiàn)了了瘧原蟲(chóng)感染相關(guān)蛋白組分的空間信息。

冠狀病毒對(duì)細(xì)胞NF-κB信號(hào)傳輸及染色質(zhì)分布的影響

Poppe等人研究了冠狀病毒對(duì)細(xì)胞NF-κB信號(hào)傳輸及染色質(zhì)分布的影響。借助激光顯微切割（LMD6000），他們分離出了表達(dá)冠狀病毒N蛋白的細(xì)胞并提取了其中的全部RNA。利用RT-qPCR和微陣列分析，他們發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞中的哪些mRNAs表達(dá)不足或表達(dá)過(guò)度。此外，他們使用冠狀病毒N蛋白質(zhì)的免疫熒光來(lái)監(jiān)測(cè)病毒感染及其在A546細(xì)胞（DMIRE2， DMi8)中的分布情況。

SARS-CoV和SARS-CoV-2都能感染腸上皮細(xì)胞

Lamers等人研究了冠狀病毒SARS-CoV-2是否不僅僅感染呼吸系統(tǒng)，還會(huì)感染人腸道。使用共焦顯微鏡 (TCS SP8) 和電子顯微鏡（EM樣本制備：EM UC7) 檢查人類(lèi)小腸類(lèi)類(lèi)器官后，他們發(fā)現(xiàn)SARS-CoV和SARS-CoV-2都能感染腸道上皮細(xì)胞。

明場(chǎng)顯微鏡在病毒學(xué)中起著直接的作用，但只是次要的作用，因?yàn)?span style="color: rgb(237, 27, 47);">熒光顯微鏡更好地滿(mǎn)足了研究人員的需求。盡管如此，在研究動(dòng)物組織時(shí)，明場(chǎng)顯微鏡還是有用武之地的。例如，研究人員可以檢查病毒感染后組織的形態(tài)變化等。

此外，明場(chǎng)顯微鏡會(huì)在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室當(dāng)中用于檢查已經(jīng)受到感染或者即將受到感染的細(xì)胞 (DM IL, DMi1, PAULA)的健康和生長(zhǎng)狀態(tài)(見(jiàn)圖5) 。

圖5：MDCK細(xì)胞（一種極化細(xì)胞系，與其他細(xì)胞系一同用于病毒學(xué)研究）的明場(chǎng)圖像。

這份顯微鏡檢查方法的清單并不全面。還有其他一些技術(shù)也可以用來(lái)可視化病毒，但不在本文的討論范圍內(nèi)。例如，電子顯微鏡（EM）可以分辨病毒顆粒。單分子檢測(cè)和熒光壽命成像（FLIM） (STELLARIS 8 FALCON)以及多光子顯微鏡 (STELLARIS 8 DIVE) 是適用于病毒學(xué)研究的其他方法。

Leica

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