生物醫(yī)學(xué)研究新工具：FLIM-FRET

熒光壽命成像（FLIM）與Förster共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）相結(jié)合，已被證明非常有利于生物醫(yī)學(xué)研究中各種結(jié)構(gòu)和細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化的研究。因?yàn)镕RET信號強(qiáng)烈依賴于FRET配體和受體的距離，所以FRET允許監(jiān)測分子相互作用。這允許研究分子的相互作用，如配體-受體復(fù)合物，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、效應(yīng)蛋白與DNA的相互作用等。

另一方面，隨著對FRET理解的深入，科學(xué)家已經(jīng)可以設(shè)計(jì)FRET探針，以便獲得可控的供體-受體結(jié)合、釋放效率。對于FRET探針，我們可以分為兩種類型的分子相互作用：探針內(nèi)的FRET供受體和探針與配體的相互作用。

今天小編將詳細(xì)介紹什么是FLIM和FRET，以及FLIM-FRET的結(jié)合帶來的幾個(gè)應(yīng)用實(shí)例。

“ 

目前，大多數(shù)生物探針都是基于熒光。熒光探針亮度的增加或減少取決于其濃度。但是，熒光強(qiáng)度不僅受研究對象濃度的影響，還受照明強(qiáng)度、光漂白以及基質(zhì)吸收和陰影效應(yīng)等。為了盡量避免這些問題，科學(xué)家傾向于優(yōu)先選擇比率染料（ratio-dyes），因?yàn)槠湓试S對背景的干擾進(jìn)行校準(zhǔn)。盡管如此，基于熒光強(qiáng)度的測量并不是非?？煽浚?yàn)榧词共捎镁脑O(shè)計(jì)的校準(zhǔn)方法，重復(fù)性也還是不夠理想。

FLIM提供了更好的方法，因?yàn)闊晒鈮勖c染料濃度、照射強(qiáng)度以及熒光信號在樣品中的吸收和散射無關(guān)，因此對分子間相互作用不會產(chǎn)生影響。另一方面，熒光壽命受環(huán)境的影響顯著，這使得FLIM可用于測量環(huán)境參數(shù)的影響：在一些特殊的分子環(huán)境情況下，存在第二種染料，其可以吸收種染料發(fā)射的能量——FRET。該過程為壽命測量提供了一種靈敏的方法。對于這種組合技術(shù)，越來越多的探針被開發(fā)出來，并用于生物醫(yī)學(xué)研究：FLIM-FRET生物傳感器。

”

什么是FLIM？

熒光的激發(fā)發(fā)生在具有適當(dāng)光子能量（激發(fā)光）的情況下。吸收光子后（藍(lán)色箭頭，圖1a），分子內(nèi)的原子釋放少量熱量（虛線圖1a）。因此，與激發(fā)光相比，發(fā)射光具有更長的波長（圖1b）。此外，能量釋放還可以通過與低能光子的相互作用來觸發(fā)（圖1c），此種情況被稱為受激發(fā)射，是STED超高分辨顯微鏡的基本原理。后，能量也可以*釋放而不發(fā)射光子，從而降低熒光效率（猝滅，圖1d）。

圖1. 熒光中的光量子變化：（a）吸收，藍(lán)色；（b）發(fā)射，綠色；（c）受激發(fā)射，紅色；（d）猝滅。涉及光子的過程以實(shí)線箭頭表示，并帶有相應(yīng)的顏色。非輻射情況以黑色虛線表示。G：基態(tài)。E：激發(fā)態(tài)。

熒光圖像通常被認(rèn)為是發(fā)射光的二維強(qiáng)度分布?？蓽y量的強(qiáng)度是激發(fā)波長或發(fā)射波長或兩者的函數(shù)。通過對一系列連續(xù)或不連續(xù)光譜獨(dú)立或同時(shí)檢測來測量發(fā)射信號。終結(jié)果用于構(gòu)建彩色圖像、分離信號通道、分辨空間和時(shí)間中目標(biāo)的相互作用等。然而，熒光過程也提供了額外的信息維度：與強(qiáng)度無關(guān)的熒光壽命。熒光壽命可用于在受控條件下識別和分離熒光物質(zhì)，并揭示分子環(huán)境的細(xì)節(jié)。

熒光激發(fā)后，熒光分子會在激發(fā)態(tài)停留一段時(shí)間，然后衰變回基態(tài)。它們處于激發(fā)態(tài)的時(shí)間是不可預(yù)測的，因?yàn)樗橇孔恿W(xué)控制的隨機(jī)過程。這種過程的一個(gè)*的例子是不穩(wěn)定原子核的放射性衰變，而每種核素的半衰期都是非常特殊的。對于熒光，處于激發(fā)狀態(tài)的時(shí)間τ即為熒光壽命。除了強(qiáng)度特征之外，熒光壽命的特殊性使其成為區(qū)分熒光染料的行之有效的方法。

a

b

c

圖2. 用激光脈沖激發(fā)后分子發(fā)射光子（紅色箭頭）的到達(dá)時(shí)間t?的測量值（藍(lán)色箭頭）。上圖a中繪制了5個(gè)測量值。b：到達(dá)時(shí)間的直方圖，包括來自a中的五個(gè)激發(fā)。重要的是＃軸，時(shí)間非常短。指數(shù)衰減曲線（紅色）擬合直方圖。c：擬合顯示，例如，兩個(gè)單衰變（藍(lán)色和綠色曲線），衰減時(shí)間τ1和τ2以及振幅A1和A2。這些的總和等于紅色衰減曲線。

因此，F(xiàn)LIM圖像不代表每個(gè)像素的強(qiáng)度，而是提供像素位點(diǎn)的壽命信息[1]。經(jīng)典的FLIM測量方法（時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)，TCSPC）確實(shí)測量單個(gè)位點(diǎn)的熒光壽命事件。像素信息是“平均到達(dá)時(shí)間”，即在該像素中測量的所有壽命事件的平均值，或者是直方圖中對到達(dá)時(shí)間進(jìn)行曲線擬合提取的一個(gè)或多個(gè)特征時(shí)間（圖4）。為了獲得顯著結(jié)果，每個(gè)像素應(yīng)該測量大約400個(gè)TCSPC。因此，我們經(jīng)常聽到的有關(guān)熒光壽命測量的抱怨：“壽命分析太復(fù)雜了！”。

圖3. 小鼠胚胎的全身FLIM圖像。722個(gè)視野拼接。SP8 FALCON采集時(shí)間約1小時(shí)（傳統(tǒng)TCSPC方法，約1天）

什么是FRET？

Förster共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）是一種影響熒光測量的淬滅現(xiàn)象。上文已經(jīng)介紹，除了發(fā)射光子，分子還可以釋放全部激發(fā)能量而不產(chǎn)生輻射（淬滅，圖1d）。如果猝滅分子也是熒光染料，則能量可以通過共振轉(zhuǎn)移到受體（A）從而供體（D）沒有發(fā)生光子輻射（圖3）。因此，釋放的能量不會作為熱量消散，而是存儲在受體熒光染料的激發(fā)態(tài)[2]。對于FRET的發(fā)生條件，受體的激發(fā)光譜必須與供體的發(fā)射光譜重疊，并且兩個(gè)分子也必須緊密接觸和排列位置適當(dāng)。在這種情況下，“緊密接觸”意味著距離不應(yīng)超過大約10納米。分子越近，F(xiàn)RET發(fā)生的概率就越高。

FRET模型

距離和轉(zhuǎn)移速率k_F之間的關(guān)系：

其中R₀表示“Förster半徑”，它是轉(zhuǎn)移效率為50％的供受體間的距離。Förster半徑假定為每個(gè)供體-受體對的特定值。供體激發(fā)的特性壽命用τ_D表示，r為兩種分子之間的實(shí)際距離。由于轉(zhuǎn)移速率與r⁶成反比，因此FRET僅在供體和受體緊密接觸時(shí)發(fā)生。由于這種關(guān)系是*的，因此，初FRET僅用于估計(jì)分子距離（“分子標(biāo)尺”）。此外，的FRET效率還取決于供體發(fā)射和受體激發(fā)的重疊程度以及兩種熒光染料的能量轉(zhuǎn)移方向。

圖4. 普通熒光和FRET：a）熒光供體分子D可以吸收光子（藍(lán)色）并發(fā)射能量較少的光子（綠色）。或者b），能量可以以非輻射地形式（黑色虛線）傳遞到相鄰的受體熒光染料A，其吸收帶寬具有與D的發(fā)射帶寬重疊的區(qū)域。與D的發(fā)射相比，受體發(fā)射的光子（紅色）能量更低。從D到A的非輻射轉(zhuǎn)移稱為“Förster共振能量轉(zhuǎn)移”即FRET。 c）FRET的 Jablonski圖。

整個(gè)過程：供體D被短波長光子Ex激發(fā)，能量以非輻射方式（FRET）傳遞給受體A，受體發(fā)射長波長光子Em。

下面兩個(gè)現(xiàn)象的發(fā)生可以辨別FRET的發(fā)生。

首先，樣品（受體）發(fā)出的熒光顏色不同于獨(dú)立供體受激發(fā)而發(fā)射的顏色。對于圖3中的示例，在藍(lán)色激發(fā)之后供體不應(yīng)發(fā)射紅色光?？梢詼y量該發(fā)射并與供體發(fā)射進(jìn)行比較的方法稱為“sensitized emission”。 Sensitized emission可量化FRET的發(fā)生。這種測量可以在活體樣本中進(jìn)行，但是如果以熒光強(qiáng)度進(jìn)行測量則需要復(fù)雜的校正，因此可以用于各種誤差校準(zhǔn)。同樣，壽命測量也是可選擇的方法。FRET對壽命的影響將在本文后一節(jié)中介紹。

其次，供體發(fā)射減少，因?yàn)橐恍┕w激發(fā)將變?yōu)槭荏w激發(fā)。這種現(xiàn)象可以用于“受體光漂白”的測量，即在通過光漂白*受體時(shí)測量供體發(fā)射的變化。去掉受體后，供體發(fā)射將增加。該方法僅適用于固定樣品。

FLIM-FRET生物傳感器

用生物方法進(jìn)行的標(biāo)記可以統(tǒng)稱為“生物傳感器”，可以是蛋白質(zhì)或肽、DNA或RNA的片段、細(xì)胞等，甚至整個(gè)生物體也可以作為生物傳感器，例如檢測污染水毒性的死亡率篩選實(shí)驗(yàn)中的淡水魚。在更大概念下，生物傳感器還可以包括含有生物學(xué)部分和光電學(xué)的用于測量分析物濃度的復(fù)合傳感器。*的是，例如，葡萄糖生物傳感器——糖尿病患者用于控制血糖的快速且簡單的裝置。FLIM-FRET生物傳感器通常表示使用熒光（壽命）作為信號并且發(fā)生FRET的熒光現(xiàn)象。

到目前為止，我們已經(jīng)了解FLIM-FRET生物傳感器的工作原理。

部分是探針：通常是與分析物（目標(biāo)分子）相互作用的蛋白質(zhì)或肽。蛋白質(zhì)和肽可以方便地通過基因工程方法引入到靶標(biāo)內(nèi)，因此是優(yōu)選的傳感分子。的例子是鈣調(diào)蛋白。鈣調(diào)蛋白可結(jié)合Ca²⁺離子并在結(jié)合或解除結(jié)合時(shí)發(fā)生構(gòu)象變化。

第二部分涉及熒光。我們需要用一對可以進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移的熒光染料標(biāo)記的分子。熒光染料分子必須以一定的方式連接到探針上，即在一種構(gòu)象狀態(tài)下它們相距很遠(yuǎn)并且不能進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移，但在替代構(gòu)象狀態(tài)下它們相距很近、且排列位置適當(dāng)，并且觸發(fā)后能進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移。當(dāng)探針結(jié)合或釋放被分析物時(shí)，F(xiàn)RET會發(fā)生或消失。我們可以通過Sensitized emission來測量結(jié)合或釋放的程度。如果使用熒光蛋白作為熒光染料，則整個(gè)生物傳感器可以在遺傳上表達(dá)，并可以被引入任何生物靶標(biāo)中，甚至是特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。適合的供受體對如：作為供體的CFP（青色熒光蛋白）和作為受體的YFP（黃色熒光蛋白）。

第三部分是壽命測量。如上所述，通過強(qiáng)度進(jìn)行的Sensitized emission測量容易出現(xiàn)明顯的誤差，并且需要麻煩的校準(zhǔn)和復(fù)雜的校正（主要是因?yàn)閺?qiáng)度受許多其他因素的影響，不僅僅是那些對FRET過程有影響的因素）。壽命基本上僅取決于熒光染料種類和所處環(huán)境的影響。在FRET的情況下，與純熒光發(fā)射相比，熒光壽命將會縮短。在圖4中，使用蓄水池（類似于激發(fā)態(tài)存儲的能量）排水來解釋壽命縮短的原因。如果供體只能發(fā)出熒光（綠色），那么相當(dāng)于只有一個(gè)排水管控制排空蓄水池的速度（a）。如果供體可以將能量轉(zhuǎn)移到受體，則猶如在蓄水池中打開第二個(gè)排水管（紅色），結(jié)果是水將更快地被排空（b）。

圖4. a）：在沒有FRET的情況下，供體分子的激發(fā)態(tài)能量庫D 僅通過發(fā)射光子來釋放能量。因此，激發(fā)態(tài)的能量僅被一個(gè)控制激發(fā)態(tài)的壽命的漏極（綠色液滴）決定；b）：如果受體分子可以從供體分子吸收激發(fā)能量，則存在第二個(gè)排出通道用于排空激發(fā)態(tài)能量庫。因此，耗盡更快，因此，在發(fā)生FRET的情況下，壽命更短。

這種壽命差異用于檢測特定分析物（分子內(nèi)FRET）結(jié)合后傳感器分子的構(gòu)象變化。當(dāng)然，可以以相同的方式研究用適合的FRET供受體中兩個(gè)分子之間的任何相互作用。

因此，如果我們測量供體的壽命變化，就可以監(jiān)測整個(gè)傳感器的構(gòu)象轉(zhuǎn)換，并由此監(jiān)測分析物濃度的變化。如果結(jié)合的構(gòu)象導(dǎo)致較低FRET的發(fā)生，則供體壽命將相對于分析物濃度增加，反之亦然。

為了以足夠的精度和速度測量體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的熒光壽命，儀器需要高靈敏度，兼具快速幀頻、以及時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)區(qū)分的適當(dāng)方法[3]。

FLIM-FRET的應(yīng)用示例

為了說明FLIM-FRET在現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)科學(xué)中的作用，小編在此舉下面兩個(gè)例子。

FLIM-FRET應(yīng)用不僅涵蓋用于分析物檢測的生物傳感器，還涵蓋蛋白質(zhì)、肽、核酸等的各種相互作用。典型地應(yīng)用如熒光蛋白CFP和YFP或衍生物的使用。為了更好的解釋原理，圖5以綠色和紅色顯示熒光的釋放。

一

細(xì)胞Ca²⁺研究

Ca²⁺離子在細(xì)胞生理學(xué)中具有許多重要作用，例如，作為細(xì)胞信號傳導(dǎo)中的第二信使。它是肌肉收縮的必需成分，能夠釋放神經(jīng)遞質(zhì)，并有助于活細(xì)胞的膜電位穩(wěn)定。它也是許多酶反應(yīng)和血液凝固的重要因子。

為了研究這些功能，有必要使用在活細(xì)胞內(nèi)快速且代謝的探針。標(biāo)準(zhǔn)FLIM-FRET生物傳感器實(shí)例之一是Ca²⁺指示劑“cameleon”（請參考本文引用文獻(xiàn)）。有各種各樣的cameleons，其名稱表示對Ca²⁺敏感性及其顏色變化，如chameleon [4]。

Cameleon探針中的傳感器是鈣調(diào)蛋白。它在與鈣結(jié)合后會發(fā)生構(gòu)象變化。具有兩個(gè)熒光蛋白，例如CFP和YFP，形成FRET-biosensor（圖5）。

圖5. 左：沒有Ca²⁺的傳感器上的兩個(gè)熒光蛋白相距較遠(yuǎn)，沒有發(fā)生FRET，熒光壽命很長。右：在Ca²⁺結(jié)合后，構(gòu)建體發(fā)生構(gòu)象變化，兩個(gè)熒光蛋白緊密接觸并發(fā)生FRET。供體的壽命變短，這是用于監(jiān)測Ca²⁺水平的信號。

Cameleon鈣傳感器在Ca²⁺離子結(jié)合時(shí)顯示FRET，即在鈣存在的情況下壽命將縮短。

二

細(xì)胞cAMP研究

細(xì)胞信號傳導(dǎo)中同樣的第二信使是cAMP，它被發(fā)現(xiàn)是盤基網(wǎng)柄菌子實(shí)體發(fā)育過程中的形狀調(diào)控因子[5]。cAMP是激素的細(xì)胞內(nèi)信使，不通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移，因此在碳水化合物循環(huán)和脂質(zhì)代謝中起關(guān)鍵作用。它還涉及一些離子通道的調(diào)節(jié)。

與cameleon類似，通過將cAMP結(jié)合蛋白Epac與兩種熒光蛋白融合，可以構(gòu)建生物傳感器[6] [7]。

圖6a. 左：沒有cAMP的Epac分子。熒光蛋白與FRET緊密接觸，壽命短。右：在結(jié)合cAMP后，構(gòu)建體發(fā)生構(gòu)象變化，使熒光蛋白進(jìn)一步遠(yuǎn)離減少FRET的發(fā)生。壽命變長。該變化用作監(jiān)測cAMP活動(dòng)的信號。

圖6b. uncaged cAMP刺激培養(yǎng)中的細(xì)胞并用Epac FRET- Biosensor 作為探針、SP8 FALCON進(jìn)行快速壽命成像。對紅色圓圈區(qū)域進(jìn)行壽命分析信號（平均到達(dá)時(shí)間t?）。曲線圖顯示了t?隨時(shí)間的變化。友情提供：K. Jalink，Bram van den Broek，荷蘭阿姆斯特丹NKI。

FLIM-FRET還可用于近些年多種熱門研究中，如非干擾性繪制細(xì)胞球3D培養(yǎng)中代謝狀態(tài)的空間和時(shí)間變化[8]，F(xiàn)RET-Biosensor（T2AMPKAR）用于監(jiān)測腫瘤球體中AMPK（5'腺苷-磷酸激活的蛋白激酶）的活性。為了充分成像球狀體的3D結(jié)構(gòu)，可以使用LEICA TCS SP8 DIVE多光子系統(tǒng)進(jìn)行激發(fā)。

這些例子只是生物醫(yī)學(xué)研究中FLIM-FRET應(yīng)用的一小部分。蛋白質(zhì)、供體與受體、DNA與蛋白質(zhì)或DNA 的片段與RNA的相互作用都可用熒光壽命結(jié)合熒光供振能量轉(zhuǎn)移的方法進(jìn)行研究。因此，F(xiàn)LIM和FRET領(lǐng)域中的研究成果將在不久的將來顯著增加！

參考

1.Gerritsen et al: Fluorescence Lifetime Imaging in Scanning Microscopy. Pawley J (Ed) Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd ed. Springer New York (2006)

2.Förster T: Energiewanderung und Fluoreszenz. Die Naturwissenschaften. 6, pp166-175 (1946)

3.Borlinghaus RT: Lifetime - a Proper Alternative. Leica Science Lab (2018)

4.Miyawaki A et al: Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature 388, pp882-887 (1997)

5.Konijn TM et al: The Acrasin Activity of Adenosine-3’-5’-cyclic Phosphate. PNAS 58, pp1152-1154 (1967)

6.Ponsioen B et al: Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO reports 5/12, pp1176-1180 (2004)

7.Klarenbeek J et al: Fourth-Generation Epac-Based FRET Sensors for cAMP Feature Exceptional Brightness, Photostability and Dynamic Range: Characterization of Dedicated Sensors for FLIM, for Ratiometry and with High Affinity. PLoS One, 10/4 (2015)

8.Chennell G et al: Imaging of Metabolic Status in 3D Cultures with an Improved AMPK FRET Biosensor for FLIM. Sensors (Basel), 16/8: 1312 (2016).